Валерий Золотухин родился в семье крестьян — председателя колхоза Сергея Илларионовича и Матрёны Федосеевны Золотухиных. С детства мечтал стать актёром и в 1958 году поступил на отделение музыкальной комедии ГИТИСа. По окончании института в 1963 году получил приглашение в Театр имени Моссовета, где проработал год.

С 1964 года Золотухин был актёром Театра на Таганке.

В кино дебютировал в 1965 году, сыграв главную роль в фильме «Пакет» по повести Л. Пантелеева.

Народный артист РСФСР (1987).

В 1994 году Валерий Золотухин вместе с правозащитником Галиной Волиной создал Благотворительный общественный фонд поддержки творчества (после смерти актёра фонд носит его имя).

С 2003 года был художественным руководителем Государственного молодёжного театра Алтая.

Автор нескольких книг воспоминаний, в том числе о Владимире Высоцком.

Сын Валерия Золотухин - Сергей (1980—2007) — барабанщик группы «Мёртвые дельфины», покончил с собой в 2007 году.

В марте 2013 года Золотухин покинул пост худрука по состоянию здоровья.

Cкончался от осложнений, вызванных опухолью головного мозга. Похоронен на территории построенного им Храма Покрова Пресвятой Богородицы в селе Быстрый Исток на Алтае.